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技術(shù)專欄

Western Blot完全指南：手把手教你避開科研深坑！

供稿：市場部

發(fā)布時間：2025-04-21

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Western Blot完全指南：手把手教你避開科研深坑！

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01.Western blot 的起源

1975年，Edwin Southern發(fā)明了DNA雜交檢測技術(shù)，命名為Southern blot。

1977年，James Alwine、David Kemp和George Stark發(fā)明了RNA雜交檢測技術(shù)，命名為Northern blot。

1979年，位于美國斯坦福大學(xué)的George Stark發(fā)明了將蛋白從電泳凝膠上轉(zhuǎn)移到活化纖維素上的技術(shù)，隨后Harry ToWestern blotin發(fā)展出更快速、簡單的“三明治”結(jié)構(gòu)電轉(zhuǎn)技術(shù)。

1981年Neal Burnette為了方便推廣這一技術(shù)正式將這一技術(shù)命名為“Western blot”

02.Western blot 的用途

①確定目的蛋白的表達情況

這是Western blot最常規(guī)的應(yīng)用，如檢測患者的標(biāo)本與正常人的標(biāo)本、實驗條件處理后細胞與未處理的對照細胞之間目的蛋白的表達變化情況，通過灰度分析可以確定目的蛋白表達水平是升高還是降低。

②研究蛋白間的相互作用

這是與免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）技術(shù)相結(jié)合的一種檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的常用方法。通過CO-IP技術(shù)將相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合體分離出來后進行凝膠電泳，然后利用相互作用的蛋白質(zhì)的特異性抗體進行檢測。適用于對已知的蛋白質(zhì)的相互作用進行檢測，不適用于檢測一個蛋白質(zhì)未知的相互作用蛋白；也可以用于蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用的后續(xù)分析。

③確定目的蛋白的細胞定位

通過分別提取細胞不同部位的蛋白質(zhì)，如膜蛋白、胞漿蛋白核蛋白或線粒體蛋白等，將分離出來的不同部位的蛋白質(zhì)進行Western blot檢測可以分別檢測目的蛋白在不同部位的表達情況。

03.Western blot 的原理

使用 Western blot 可以測定樣本間的蛋白表達相對量，同時確定靶蛋白的分子量，有助于進一步了解翻譯后加工。為了實現(xiàn)這一點，Western blot 共分為 3 個步驟：(1) 按照分子量大小分離蛋白；(2) 轉(zhuǎn)移到固相載體上；(3) 使用一抗和二抗對靶蛋白成像。

01.通過凝膠電泳按照分子量大小分離蛋白。

02.將凝膠緊貼膜放置，同時施加電流引導(dǎo)蛋白從凝膠遷移到膜上。進行免疫染色時，由于電泳凝膠不利于抗體與其中的蛋白結(jié)合，所以需要進行蛋白轉(zhuǎn)膜。

03.過靶向目標(biāo)蛋白的特異性抗體進一步孵育膜，再通過二抗和檢測試劑顯示檢測信號。

04.Western blot 抗體選擇

避坑指南：抗體選擇的黃金法則

Western blot 的靈敏度和特異性取決于抗體的質(zhì)量和使用抗體的實驗條件。在使用含有血清和內(nèi)源性免疫球蛋白的組織裂解液或組織培養(yǎng)上清液時，所選一抗的種屬應(yīng)有別于樣本種屬。例如，如果您研究的是小鼠蛋白，應(yīng)選擇在非小鼠的種屬中培養(yǎng)的一抗（例如在兔中培養(yǎng)的一抗）。這是為了避免免疫球蛋白二抗與樣本中的內(nèi)源性免疫球蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。使用不含內(nèi)源性免疫球蛋白的樣本時，一抗宿主種屬的選擇相對沒那么嚴格。

為了使蛋白顯色，需要選擇一種可與一抗結(jié)合的（不同于一抗宿主種屬的）二抗。使用酶聯(lián)二抗，例如辣根過氧化物酶 (HRP) 偶聯(lián)抗體或堿性磷酸酶 (AP) 偶聯(lián)抗體，或者經(jīng)Western blot 優(yōu)化的熒光偶聯(lián)抗體，可以提高靈敏度。記得確認偶聯(lián)抗體的光發(fā)射波長是否與您的讀數(shù)裝置/掃描儀兼容。

與單獨的一抗相比，偶聯(lián)二抗的靈敏度更高，因為二抗可以在多個位點與一抗結(jié)合，從而增強信號。信號增強有利于檢測復(fù)雜蛋白混合物中的目標(biāo)蛋白，所以二抗非常適合用于 Western blot。